Hatten das 15. und das frühe 16. Jh. die Bildung des Landes A. und die Besserstellung dieses Staatswesens in der Eidgenossenschaft gebracht, so vollzogen sich im 16. Jh. dessen Trennung in zwei konfessionelle Lager und letztlich die Teilung in zwei Halbstände.
Grundlegend für diese politische Entwicklung war die Glaubensspaltung. Die Lehren Luthers und Zwinglis sollen vornehmlich in den äusseren Rhoden erste Anhänger gewonnen haben. Um das konfliktträchtige Nebeneinander von altem und neuem Glauben innerhalb der Kirchhören zu beenden, entschied die Landsgemeinde vom April 1525, dass jede Kirchhöre sich für einen Glauben entscheiden, danach aber Freizügigkeit bestehen solle, damit sich die konfessionelle Minderheit in einer Kirchhöre ihres Bekenntnisses niederlassen könne («Kirchhöreprinzip»). Die äusseren Rhoden -- ausser Herisau, wo Joseph Forrer, ein energischer Verfechter des alten Glaubens, die Reformation bis 1529 verhinderte -- entschieden sich zusammen mit dem zu den inneren Rhoden gehörenden Gais für die neue Lehre. Die Bewohner der inneren Rhoden in der Kirchhöre Appenzell unter Pfarrer Diepolt Huter verblieben mehrheitlich beim alten Glauben.
Von der Mitte des 16. Jh. an versuchte eine neue massgebende Gruppe von Innerrhoder Politikern den politischen Verbindungen zu den Innerschweizer Orten eine religiöse Komponente zu geben. Die katholische Reform und die Gegenreformation sind mit der Appenzeller Geschichte der 2. Hälfte des 16. Jh. beispielhaft verflochten. Entscheidenden Einfluss auf den Fortgang der katholischen Erneuerung, aber auch auf das Aufkeimen konfessioneller Spannungen, hatten 1586 die Berufung der Kapuziner nach Appenzell. Die gegenreformatorische Tätigkeit der Kapuziner, führte zunächst zum Glaubensvertrag vom 1.3.1588, welcher das Kirchhöre- und das Schriftprinzip erneuerte. In strenger Auslegung des Kirchhöreprinzips wurde in der Kirchhöre Appenzell die reformierte Minderheit vor die Wahl gestellt, sich zur katholischen Konfession zu bekennen oder auszuwandern, wodurch die konfessionelle Einheit der inneren Rhoden wiederhergestellt wurde.
Auf der anderen Seite betonten auch die äusseren Rhoden ihre Eigenständigkeit in religiösen Fragen, was sich bis in alltäglichen Angelegenheiten auswirken konnte (Abschaffung alter bzw. kath. Bräuche, Versuch der Trogener, den Altarstein aus der Kirche zu schaffen). Der Glaubensvertrag bewirkte eine grosse Verstimmung in den äusseren Rhoden, die in ihrem Gebiet mit gleichen Massnahmen gegenüber den katholischen Minderheiten reagierten.
Der Graben zwischen den im Glauben und in der Aussenpolitik zerstrittenen Appenzellern war nun so tief geworden, dass die eidgenössischen Vertreter nach dem Scheitern aller Vermittlungsversuche eine Trennung der beiden unverträglichen Landesteile nicht mehr ausschlossen. Am 2. Juni1597 stimmten die äusseren Rhoden an einer ausserordentlichen Landsgemeinde in Hundwil der Teilung des Landes zu, und am 15. Juni 1597 fällte die Kirchhöreversammlung von Appenzell denselben Entscheid. Sechs an der Tagsatzung gewählte Schiedsrichter von Zürich, Luzern, Schwyz, Nidwalden, Glarus und Schaffhausen führten in Appenzell Verhandlungen mit den beiden Parteien und legten am 8.9.1597 den Landteilungsbrief vor, der die endgültige Trennung in zwei Staatswesen in die Wege leitete. App. Innerrhoden und App. Ausserrhoden erhielten fortan den Status von Halbständen und nahmen in Kauf, dass ihr Einfluss in der Eidgenossenschaft wegen ihres konfessionellen Gegensatzes geschwächt wurde. Mit dem Teilungsbeschluss konnte in bemerkenswerter Ruhe und ohne Blutvergiessen eine dauerhafte Konfliktlösung gefunden werden.
Erst nach der Gründung des schweizerischen Bundesstaats 1848 wurde die Niederlassungsfreiheit im ganzen Land ein zentrales Thema der Gesetzesreformen. Trotz Opposition wurden Personen christlicher Konfession aus anderen Kantonen den Einwohnern des Wohnsitzkantons praktisch gleichgestellt (Art. 41 der Bundesverfassung von 1848). Dies wiederum verpflichtete die beiden Appenzeller Halbkantone ihre Verfassungen anzupassen und ihr Hoheitsgebiet für den Zuzug von Christen der jeweils anderen Konfession zu öffnen. Ganz zögerlich begannen sich Katholiken in Ausserrhoden niederzulassen und erste Pfarreien (Missionsstationen) zu gründen.